市場上細(xì)胞計(jì)數(shù)儀琳瑯滿目，那么這些細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的方法和原理主要是哪些呢？

 1.手工顯微鏡法

 又稱血球計(jì)數(shù)板法，是原始的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，顯微鏡下調(diào)整不同放大倍數(shù)的物鏡，通過染色的方法人工觀察細(xì)胞狀態(tài)判斷細(xì)胞死活，進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過檢測出一定體積的均勻細(xì)胞懸液中的細(xì)胞個(gè)數(shù)（對(duì)一定數(shù)量的小格或中格計(jì)數(shù)，根據(jù)相應(yīng)的小/中格所占的體積，可以推算出單位體積的溶液中微生物細(xì)胞的密度或總數(shù)），換算出每毫升的細(xì)胞個(gè)數(shù)，從而得到細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度。實(shí)驗(yàn)過程中采用五點(diǎn)取樣法，即一般隨計(jì)數(shù)室四角上的四個(gè)中方格以及正中間的一個(gè)中方格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（對(duì)于壓線的，采取數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則）。這種方法數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，按照1個(gè)細(xì)胞計(jì)算。

圖1、血球計(jì)數(shù)板             

2.庫爾特原理

又稱電阻抗檢測原理。細(xì)胞是相對(duì)不良導(dǎo)體，當(dāng)細(xì)胞懸浮電解質(zhì)中，將小孔管插入細(xì)胞懸液，使其管內(nèi)充滿稀釋液，位于小孔管兩側(cè)電極產(chǎn)生穩(wěn)定電流。當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過小孔時(shí)，瞬間引起電壓變化出現(xiàn)一個(gè)脈沖信號(hào)，細(xì)胞體積越大，引起脈沖越大，產(chǎn)生脈沖振幅越高，脈沖信號(hào)由下列步驟完成：①放大；②閾值調(diào)節(jié)；③甄別；④計(jì)數(shù)。采用這種計(jì)數(shù)原理的儀器具有代表性的是CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，這種原理的儀器內(nèi)置液路系統(tǒng)，需要定期清洗管路防止堵塞。

圖2、電阻抗法細(xì)胞計(jì)數(shù)原理

3.圖像法

通過高清攝像鏡頭獲取高清的樣品圖片，根據(jù)活死細(xì)胞的形態(tài)、顏色，軟件智能分析圖片的結(jié)果。目前市場上采用這種方法的儀器大致分為兩類，一類是明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀僅需簡單的臺(tái)盼藍(lán)染色，另一類是熒光場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，需要相應(yīng)的熒光染料。

（1）經(jīng)典臺(tái)盼藍(lán)染色原理（明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：臺(tái)盼藍(lán)是細(xì)胞跨膜染料，活細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，臺(tái)盼藍(lán)無法通過，細(xì)胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細(xì)胞膜通透性改變，臺(tái)盼藍(lán)可跨過死細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞顏色加深，呈現(xiàn)實(shí)心的圓點(diǎn)與活細(xì)胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據(jù)這種形態(tài)的差異可以明顯區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別計(jì)數(shù)。市場上明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均是采用這種臺(tái)盼藍(lán)原理進(jìn)行活死細(xì)胞計(jì)數(shù)。我們Countstar明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀一代需要外接電腦的Biotech和二代一體機(jī)Altair就是采用臺(tái)盼藍(lán)染色原理進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖3、Countstar 明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及檢測結(jié)果

我們的明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，無論是Biotech還是Altair均選取3個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢測視野的面積是血球計(jì)數(shù)板的6倍以上，這種高通量的樣本采樣量減少統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。另外，軟件部分采用智能分析方法，分別圈出活細(xì)胞、死細(xì)胞、成團(tuán)細(xì)胞，成團(tuán)細(xì)胞根據(jù)檢測的平均直徑智能分割，確保聚團(tuán)細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性。我們Counstar具有自主研發(fā)的“定焦”技術(shù)，無需手動(dòng)調(diào)焦和自動(dòng)定焦，保證樣品檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。Tips：有部分使用者采用明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀時(shí)，直接用細(xì)胞原液上樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，沒有使用臺(tái)盼藍(lán)染色，檢測結(jié)果僅供簡單的查看，沒有實(shí)際的參考意義。

圖4、Countstar明場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測結(jié)果分析

（2）AO/PI熒光染色原理（熒光場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）：AO/PI為細(xì)胞核染料，AO為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使有核細(xì)胞標(biāo)記上綠色熒光。PI是碘化丙啶一種大分子染料，只有細(xì)胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞的核標(biāo)記上紅色熒光。AO/PI染細(xì)胞后，死細(xì)胞會(huì)同時(shí)染上AO和PI，AO的發(fā)射光波長532 nm左右，PI的激發(fā)光波長剛好與AO發(fā)射光波長相重，兩種染料同染上死細(xì)胞核時(shí)會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），AO的發(fā)射光被PI吸收，所以死細(xì)胞只會(huì)顯示紅色熒光，而活細(xì)胞只有綠色熒光。因此，通過特異性染色的細(xì)胞上標(biāo)記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細(xì)胞和活細(xì)胞。目前市場上熒光場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀基本采用這種計(jì)數(shù)原理，這種計(jì)數(shù)方法的特異性染色可以排除無核細(xì)胞、雜質(zhì)、碎片等的干擾，主要用于原代細(xì)胞、培養(yǎng)時(shí)間長后期發(fā)酵細(xì)胞、PBMC細(xì)胞（排除紅細(xì)胞、血小板等無核細(xì)胞、雜質(zhì)的干擾）等。下圖是我們Countstar Rigel（全自動(dòng)熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)儀）產(chǎn)品通過AO/PI進(jìn)行PBMC細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果圖。

圖5、Countstar熒光場細(xì)胞計(jì)數(shù)儀AO/PI計(jì)數(shù)

4.流式細(xì)胞術(shù)

利用流式細(xì)胞術(shù)使單個(gè)細(xì)胞隨著流體動(dòng)力聚集的鞘流液在通過激光照射的檢測區(qū)時(shí)，使光束發(fā)生折射、衍射和散射，散射光檢測器接收后產(chǎn)生脈沖將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，脈沖大小與被照細(xì)胞的大小成正比，脈沖的數(shù)量代表了被照細(xì)胞的數(shù)量。流式細(xì)胞術(shù)需要用到較為昂貴的特異性熒光試劑和相應(yīng)的激發(fā)光、濾波片，使用成本較高，因此基本不采用流式細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，而是進(jìn)行細(xì)胞群分析。

5.結(jié)語

細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞相關(guān)試劑（抗體、疫苗、細(xì)胞治療產(chǎn)品）的重要一環(huán)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、便利性、成本等是使用者重要的參考指標(biāo)。目前成像法原理的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀因其可以直觀看到細(xì)胞形態(tài)以及軟件分析前后結(jié)果對(duì)比的優(yōu)勢(shì)在其他計(jì)數(shù)原理的產(chǎn)品中脫穎而出，深受廣大科研人員喜愛，下表是對(duì)上述原理分析的統(tǒng)計(jì)。